Potwierdziliśmy mutacje za pomocą DNA uzyskanego od rodziców pacjentów; w przypadku niedostępności rodzicielskiego DNA stosowaliśmy subklonowanie, a następnie analizę sekwencji w celu wykazania, że zmutowane allele tworzące heterozygotyczną mutację złożoną pochodziły z różnych macierzystych chromosomów. Próbki DNA od pacjentów z diagnozą achondrogenezą typu 1A (Online Mendelian Inheritance in Man number, 200600) zostały dostarczone przez trzy ośrodki referencyjne, które specjalizują się w klinicznej, radiologicznej i histologicznej charakterystyce dysplazji szkieletowej. Każde centrum referencyjne otrzymało pisemną zgodę na zbieranie i analizowanie DNA. Instytucjonalna komisja egzaminacyjna w szpitalu dziecięcym w Bostonie zatwierdziła analizę próbek DNA, które pozbawiono informacji identyfikujących, zanim zostały przeniesione z ośrodków referencyjnych.
Test transportowy
Przygotowaliśmy adenowirus eksprymujący wrażliwe na temperaturę wirusowe białko G z pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej połączone z białkiem o zielonej fluorescencji (VSVGts-GFP), jak opisano wcześniej6. Przebadaliśmy przetwarzanie VSVGts-GFP w heterozygotycznych i zmutowanych fibroblastach skóry hodowanych w sześcio-studzienkowych płytkach hodowlanych. Test powtórzono trzy razy w oddzielnych dniach i wykonano trzykrotnie za każdym razem. (Więcej informacji na temat hodowli fibroblastów można znaleźć w Załączniku uzupełniającym, pełnym tekście tego artykułu, preparatach szkieletowych, analizie histologicznej, hybrydyzacji RNA in situ, mikroskopii elektronowej, monitorowaniu różnicowania chondrocytów, proliferacji i apoptozy, barwieniu immunofluorescencyjnym kultur komórki i zamrożone sekcje, immunodetekcję GMAP-210 i test na sygnalizację hedgehog).
Wyniki
TRIP11 i Mutant Mouse Phenotype
Ryc. 1. Ryc. 1. Wpływ mutacji Trip11 u myszy. Panel A pokazuje mysz płodową typu dzikiego i mysz płodową z indukowaną bezsensowną mutacją w Trip11, genie kodującym GMAP-210, w zarodkowym dniu 18.5. Mysz z mutacją ma kopułową czaszkę, krótki pysk, krótki pień, krótkie kończyny i przepuklinę (strzałę). W panelu B (u góry), wybarwienie chrząstki błękitem alcian i kością z czerwienią alizarynową na embrionalnym dniu 17,5 u myszy typu dzikiego i myszy z mutacją Trip11 ujawnia brak mineralizacji w czaszce (grot strzałki), klatce piersiowej i kończyny (strzałki) w mutancie. W panelu B, na dole, barwienie chrząstki i kości w kręgosłupie nowonarodzonych myszy dzikiego typu i zmutowanych ujawnia brak mineralizacji w trzonie kręgu mutanta (strzałka). W panelu C, immunoblotting GMAP-210 w immunoprecypitowanych próbkach pierwotnych fibroblastów skóry z myszy typu dzikiego, heterozygotycznej myszy i zmutowanej myszy pokazuje, że GMAP-210 nie jest wykrywalny w zmutowanych fibroblastach. IgG, który był stosowany w reakcji immunoprecypitacji, służy również jako kontrola obciążenia. W panelu D hybrydyzacja in situ próbek obręczy barkowej typu dzikiego i kości ramiennej uzyskanych w zarodkowym dniu 15.5 za pomocą sond antysensowych i sensownych RNA Trip11 pokazuje ekspresję Trip11 we wszystkich typach komórek, przy braku zwiększonej ekspresji w chrząstce (strzałka) i kości (grot strzałki). Czerwony oznacza ekspresję mRNA Trip11
[patrz też: sulfadiazyna, fala uderzeniowa łódź, odbudowa zęba na wkładzie z włókna szklanego ]
Powiązane tematy z artykułem: fala uderzeniowa łódź odbudowa zęba na wkładzie z włókna szklanego sulfadiazyna